上一期小赛给大家分享了一篇KingFisher纯化细胞的文章，获得了很多小伙伴的关注，这次小赛又给您带来了一篇KingFisher做蛋白纯化的文章，KingFisher仪器不仅能用于新冠病毒的检测，还能用于新冠药物靶点的研究。

2020年5月，一篇名为 “A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing” 的重磅论文在Nature上发表，推动治疗新冠药物的研发进程。论文通过揭示SARS-CoV-2病毒与人类蛋白相互作用（protein–protein interaction, PPI）的图谱来揭示病毒如何劫持细胞系统，找到了332个SARS-CoV-2蛋白与人类蛋白质之间的相互作用关系，并鉴定出69种能靶向干扰的化合物。这项研究无论对于“老药新用”治疗新冠疾病，还是对于指明新药的研发方向，都有重要的意义。

值得一提的是

科学家在研究中使用了全自动纯化系统KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific) 和质谱分析仪Q Exactive Orbitrap Mass Spectrometers (Thermo Fisher Scientific) 来实现亲和纯化质谱（affinity purification mass spectrometry，AP-MS），快速找到了药物靶点，为新冠药物开发助力。

研究方法

他们首先单独研究了 29 种 SARS-CoV-2 蛋白中的 26 种（表1）。

表1. SARS-CoV-2蛋白表，包括分子质量、与SARS-CoV同源物的序列相似性以及基于SARS-CoV同源物的推断功能。

如何快速找到这26种病毒蛋白会与人体里的哪些蛋白产生相互作用呢？

研究人员利用在 HEK293T/17 细胞中表达的病毒蛋白进行亲和纯化质谱（AP-MS）。SARS-CoV-2 病毒蛋白经过密码子优化并克隆到带有亲和标签（或诱饵）的哺乳动物表达载体中。在宿主细胞中表达这些病毒蛋白后，通过高通量的纯化系统KingFisher Flex，在与宿主蛋白相互作用的背景下纯化病毒蛋白并通过多次纯化洗涤，尽量避免杂蛋白的干扰。最后，结合质谱分析得到的数据，生成SARS-CoV-2蛋白和人类蛋白之间的 PPI 图谱（图1）。

图1. AP-MS鉴定SARS-CoV-2宿主蛋白-蛋白质相互作用的实验流程。

根据这些蛋白相互作用的数据，科学家们在已经批准的药物、正在临床试验的药物、以及尚未进入临床试验的化合物中，寻找能够选择性干扰病毒蛋白-人类蛋白相互作用的分子。

为了进一步证明药物的抗病毒性，研究团队与两个正在实验室中处理 SARS-CoV-2 病毒的研究小组合作，在 Vero 细胞培养病毒检测中测试病毒。

主要发现1

绘制SARS-CoV-2病毒蛋白与人体蛋白相互作用网络

研究团队首次系统分析了SARS-CoV-2在感染过程中可能与哪些人类蛋白质相互作用。用亲和纯化质谱法（AP-MS）对27个标记的病毒蛋白（26种新冠病毒蛋白和1种突变体蛋白）进行分析，基于蛋白质之间的相互作用，确定新冠蛋白与人类蛋白质的作用关系，并鉴定了332种高置信度新冠蛋白-人类蛋白相互作用网络（图2）。

图2. SARS-CoV-2蛋白-蛋白相互作用网络。26种SARS-CoV-2蛋白(红色菱形)与人类蛋白(圆形;药物靶点:橙色;蛋白复合物:黄色;同一生物过程中的蛋白质:蓝色)之间332种具有高置信度的相互作用。

为了进一步验证互作蛋白，研究团队研究了人类相互作用蛋白的生物学功能、解剖表达模式、SARS-CoV-2感染期间的表达变化以及与宿主-病原体相互作用蛋白的其他图谱。科学家发现这些新冠病毒蛋白参与基因调控、信号转导、应激反应等多个关键细胞进程。约40%蛋白互作蛋白与内室或者囊泡运输途径有关。其中新冠病毒会对多条先天免疫系统通路如干扰素通路和 NF-κB通路等产生负面影响。此外，两个调节抗病毒先天免疫信号通路的人类蛋白，也会被新冠病毒蛋白所靶向和针对。

主要发现2

筛选干预蛋白相互作用网络的现有药物

通过研究蛋白互作，科学家找到了这些潜在的药物靶点。通过整理这些会与新冠蛋白相互作用的蛋白信息，科学家们对比FDA的数据，在已经批准的药物、正在临床试验的药物、以及尚未进入临床试验的化合物中，找到了69个能够选择性干扰新冠蛋白与人类蛋白相互作用的化合物（图3）。在这69种化合物中，27种为已经通过FDA批准上市的药物，另外还有14种药物目前还处于临床研究阶段，剩余28种还未进入临床研究。

图3. 药物和人类靶点的网络。图中显示了SARS-CoV-2毒饵与已批准药物(绿色)、临床候选药物(橙色)和临床前候选药物(紫色)的蛋白-蛋白相互作用，以及针对宿主蛋白(白色背景)或已知宿主因子(灰色背景)的实验活动。

是否这69种化合物都具有抗病毒活性呢？为了在体外测试这些药物，他们在纽约和巴黎做了病毒感染性实验（图4）。在纽约西奈山医院，他们开发了一种中通量免疫荧光技术分析(检测病毒NP蛋白)筛选37种化合物，研究Vero E6细胞系SARS-CoV-2感染的抑制作用；在法国的巴斯德研究所，另一批科学家通过PCR (RT-qPCR)检测44种药物和化合物。这两个实验发现了两类分子能减少病毒的感染性：mRNA 翻译抑制剂和 Sigma1 和 Sigma2 受体的预测调节因子。后续研究表明，这些分子作用于病毒入侵细胞之前，可以起到阻断病毒感染的作用。

图4. 病毒感染性试验示意图。

为了理解这些抑制剂发挥抗病毒作用的机制，科学家进行了时间过程实验，在感染前或感染后不同时间添加药物。结果显示（图5）PB28、佐他替芬 (Zotatifin) 和羟基氯喹均降低了病毒的检出，此外，这三种分子在病毒侵入后的感染后4小时内均能抑制NP的表达。因此，这些分子似乎在病毒复制过程中发挥其抗病毒作用。

图5. 感染前后添加药物的抗病毒作用区别。在添加高滴度病毒(MOI = 2)之前或之后添加药物，抗病毒效果相似。

在本研究中，KingFisher Flex帮助研究人员解决了以下问题：

1. 纯化的均一性。96通量蛋白样本在亲和纯化时在同一条件下完成，实验更严谨。

2. 提高实验效率。AP-MS实验涉及大量的标签蛋白纯化，全自动纯化系统KingFisher Flex代替手工操作，节约时间，可重复性强。

3. 实验准确性。多档速度可调搭配高吸附磁珠，实验过程中，尽可能多的标签蛋白被纯化出来，提高药物靶点研究的准确性。

参考文献

David E. Gordon, Gwendolyn M. Jang, et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature 2020, 583, 459–468